基于重大疾病的创新药物研究团队最新研究进展-药物关键制备技术教育部重点实验室

基于天然产物Uncinine，设计合成了α-氨甲基取代-γ-内酯类化合物，筛选发现了具有进一步优化的先到化合物，其在体内外均表现出了抗肿瘤活性，细胞水平表现出了良好的选择性。作用机制研究表明,其可以通过提升肿瘤细胞内活性氧的水平，上调DR5蛋白，同时调节线粒体细胞凋亡通路，从激活Caspase蛋白，诱导肿瘤细胞凋亡。

其具体研究工作如下：

1.Z-1表现出了良好的体内抗肿瘤活性。

采用MGC803细胞裸鼠移植瘤模型评价Z-1的体内抗肿瘤作用。结果表明，20mg/Kg给药剂量，连续给药21天，Z-1对肿瘤的生长表现出了良好的抑制作用。抑瘤率达到了40%左右（图20），对小鼠的体重没有明显的影响。

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图20 Z-1 20mg/Kg剂量连续给药21天的对MGC803细胞移植肿瘤的抑制作用

2.Z-1能够明显的诱导MGC803细胞凋亡，并且表现出了caspase蛋白依赖性

细胞水平评价的结果表明Z-1能够明显的诱导肿瘤细胞凋亡（图21A，21B），在体内也表现出了良好的抗肿瘤作用。为了进一步的阐明Z-1作用机制，以MGC803为研究对象，研究了Z-1处理细胞后，凋亡相关蛋白Caspase蛋白表达的变化。研究结果表明，药物处理后caspase3和caspase9以及PARP-1的表达量明显下调，活性的caspase9表达量明显上调（图21C）。为了进一步验证，Z-1诱导的细胞凋亡是否是caspase依赖的，采用泛caspase抑制剂Z-VAD-fmk处理MGC803细胞，可以逆转Z-1诱导的细胞凋亡（图21D，21E）。上述结果证明Z-1诱导MGC803细胞凋亡是Caspase依赖性的。

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图21Z-1诱导的MGC803细胞凋亡

3.Z-1调节Bcl-2家族家族蛋白表达，诱导细胞凋亡

线粒体在细胞凋亡过程中扮演着不可或缺作用，其作业主要有Bcl-2家族蛋白调节。为了研究线粒体在Z-1诱导的肿瘤细胞凋亡中的作用，我们分别检测了MGC-803细胞经Z-1处理后，线粒体膜电位的变化以及Bcl-2家族凋亡相关蛋白表达的变化。结果表明，经Z-1处理过后，MGC803细胞膜电位明显下降（图22A），抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL明显下调，而促凋亡蛋白Bax的表达明显上调（图22B）。另外，IAP家族中最强的的凋亡抑制因子X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）也明显下调。上述研究结果表明，线粒体通路在Z-1诱导的MGC803细胞凋亡的过程中扮演重要作用。

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图22 Z-1处理（24h）对MGC803细胞Bcl-2蛋白表达的影响

4.Z-1诱导MGC803细胞凋亡与死亡受体DR5有关

细胞凋亡是一个主动的、信号依赖的过程，可以由许多因素所诱导，如放射线照射、毒素、药物、缺血缺氧、病毒感染等。研究发现，这些因素大多可以通过激活死亡受体而触发细胞凋亡机制。Z-1能够明显的上调DR4，DR5的水平以及和DR相互作用的FADD的水平（图23A）。上述结果表明，Z-1诱导的肿瘤细胞凋亡和DR5相关。因此，我们构建了DR5敲出的MGC803细胞，并对比了Z-1处理分别对野生型和DR5敲出型MGC803细胞中DR5表达的影响。结果表明，Z-1能够显著上调DR5的表达（图23B），并且DR5 KO MGC803比野生型的MGC803表现出了更高的活力（图23C，D）。同时，检测到DRKO MGC803细胞经Z-1处理后，凋亡相关蛋白比如BaxDR5，活性的caspase3和9以及CF-PARP上调水平降低（图23E）。

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图23Z-1处理（24h）对MGC803细胞DR5蛋白表达的影响

Both wild type and DR5^-/-MGC803 cells were treated with 20 μM of Z-1 for 24 h. (A) DR4, DR5 and FADD proteins expression were detected by western blotting at a dose-dependent manner in MGC803 cells. (B) DR5 protein expressions in MGC803 cells were determined by flow cytometer analysis after Z-1 incubation. (C) Cell viabilities were measured by MTT assay after 24 h Z-1 incubation at 20 μM. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. untreated group. (D) The ratios of apoptotic cells were determined by flow cytometric analysis after Z-1 incubation for 24 h. (E) The expression levels of apoptosis-related proteins were tested by western blotting assay after Z-1 incubation.

5.Z-1诱导的肿瘤细胞凋亡与活性氧（ROS）有关

活性氧直接诱导细胞凋亡，图24A表明，Z-1处理的MGC803细胞中活性氧的水平时间依赖性的增加。并且Z-1诱导的细胞凋亡几乎可以完全被活性氧清除剂NAC完成逆转（图24B,C）。此外，线粒体膜电位MMP（24D）和Bcl-XL,Bid, CF-PARP-1, PARP-1, BAX, DR5以及Caspase的表达也被部分逆转（图24E），在HGC27和SGC7901细胞株上有类似的想象(图24E)。

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图24Z-1处理（24h）对MGC803等细胞ROS产生水平的影响

(A) Measurement of ROS. The level of ROS was measured by DCFH-DA with flow cytometry. MGC803 cells were treated with Z-1 (20 μM) for different periods of time. (B)MTT assay demonstrated the effect of NAC (5 mM) on Z-1(20 μM)-induced cell death of MGC803, HGC27 and SGC7901 cells at 24h.** p < 0.01 vs. untreated group. (C) The effects of ROS inhibitor NAC (5 mM) on Z-1 (20 μM)-induced cell apoptosis of MGC803 cells were detected by Annexin V/PI assay for 24 h. (D)The mitochondria membrane potential (ΔΨ)was measured by JC-1 dye retention using flow cytometry in MGC803 cells. (E) Western blotting assay was used to detect the expression levels of apoptosis-related proteins after pretreatment with ROS inhibitor NAC (5 mM) in MGC803, HGC27 and SGC7901 cells for 1 h followed by 24 h Z-1 (20 μM) incubation.

综上，基于天然产物来源化合物为基础，设计、合成、筛选，发现了先导化合物Z-1。其表现出了良好的体内外抗肿瘤活性，并且对胃癌细胞和正常的胃上皮细胞表现出了良好的选择性，值得开展深入的优化研究。机制研究结果表明，其可以通过提升肿瘤细胞内活性氧的水平，上调DR5蛋白，同时调节线粒体细胞凋亡通路，从激活Caspase蛋白，诱导肿瘤细胞凋亡。